Elektroforese van DNA

1.Onderzoeksvraag

Cor Naval I is dood teruggevonden in bad. Iedere verdachte beweert aanwezig geweest te zijn op het unikleur schilderfestijn (schilderfeest waarbij elke deelnemer schildert met 1 verfkleur). Er is een mengsel teruggevonden van alle gebruikte kleuren tijdens het festijn. Elke verdachte geeft aan met welke kleur hij/zij heeft gewerkt tijdens het feest.

2.Voorbereiding

a. Begrippen

DNA: drager van erfelijke informatie die aanwezig is in alle organismen.

Elektromagnetisch kracht: kracht die elektrische geladen deeltjes voelen door elektromagnetische velden.

Ionlading: Lading van een ion.

Ion: Geladen deeltje.

Anode: Elektrode waar de oxidatie gebeurt.

Kathode: Elektrode waar de reductie gebeurt.

Elektrolyse: is een proces waarbij met een externe spanningsbron een niet-spontane
redoxreactie optreedt.

Redoxreactie: of elektronenuitwisselingsreactie is een reactie waarbij het oxidatiegetal van één atoom toeneemt en het oxidatiegetal van het ander atoom afneemt.

Deeltjesgrootte: De grootte van een deeltje, bepaald door de kleinste dimensie.

b. Materialen

Elektroforese apparaat + dienblad
Micropipetten
Vormingskam
2 snoeren
2 bekerglazen van 250ml
Waterbad 100°C
DNA-stalen of een set van kleurstoffen.
15ml agarose 2,0%
40ml van 5x TBE running buffer (zie bereiding oplossing)
5 batterijen van 9V
Tape
160ml gedestilleerd water

Bereiding EDTA 0,5M:

Weeg 93,05g dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) af.
Leng de oplossing aan tot 500ml met gedestilleerd water.

Bereiding TBE:

Voorraadoplossing:

Weeg 54 g Tris base: 2-Amonium-2-hydroxymethyl-propaan-1,3-diol af.
Weeg ook 27,5 g boorzuur af.
Doe dit in een bekerglas en leng aan met gedestilleerd water tot 900ml.
Voeg 20 ml van 0,5 M EDTA ( pH 8,0 ) : ethyldiaminetetraazijnzuur toe.
Leng verder aan tot 1l.

Bewaar de buffer bij kamertemperatuur in een glazenfles en gooi de buffer weg als er een neerslag gevormd is.

Voor elektroforese:

TBE kan 0,5/1 X verdund worden voor gebruik in elektroforese.

c. Opstelling

d. Veiligheid

3. Uitvoeren

a. Werkwijze

Afhankelijk van de Kit werk je in 1 deel of 2 delen: In deel 1 ga je de gel zelf maken voor de elektroforese. Als deze voorzien is kan je meteen naar deel 2 voor de uiteindelijke elektroforese.

Deel 1: Agarose Gel maken

Tape de beide open kanten van het dienblad af zodat er daarna geen lekken kunnen ontstaan.
Steek daarna de vormingskam in het middelste gleufje van het dienblad.
Smelt nu de agarose door de stop van de fles te draaien en de fles in een warm waterbad van minstens 100°C te plaatsen.
Kook de agarose tot het helemaal vloeibaar is.
Giet ongeveer 15ml van de vloeibare agarose in het afgeplakte dienblad. Zorg ervoor dat er geen agarose lekt aan de getapte kanten.
Laat de agarose stollen door 20-30 minuten te wachten. Verstoor de gel op geen enkele manier in deze tijd.
Nadat de agarose goed gevormd is, verwijder je de vormingskam door ze zachtjes eruit te trekken. Verwijder daarna zachtjes de tape rond het dienblad.

Deel 2:

Neem nu het DNA/kleuren-stalen: doe hier 10µl van staal 1 in de eerste rij.

doe 10µl met de micropipet van de referentiestaal in de eerste rij
doe 10µl met de micropipet van staal 1 in de tweede rij.
doe 10µl met de micropipet van staal 2 in de derde rij.
…

Zorg ervoor dat je de putjes in de agarose niet doorboort.Zorg ervoor dat de putjes niet overlopen

Plaats het dienblad met de geladen gel in het midden van de elektroforese kamer met de putjes zo dicht mogelijk naar de negatieve (zwarte) elektrode toe.
Maak nu de buffer: Voeg in een bekerglas 160ml gedestilleerd water en 40ml 5X TBE en meng even.

Giet nu ZACHTJES de buffer in de elektroforese kamer. Als dit te snel gaat kunnen de stalen wegspoelen.
Giet de buffer tot het ongeveer 2 tot 3 mm boven de gel uitkomt. Indien het dienblad begint te drijven gebruik dan een pipet om de lucht onder het dienblad te verwijderen.
Sluit de elektroforese kamer af. Als je ergens gemorst hebt op het elektroforese apparaat ga je deze eerst opvegen
Sluit 5, 9V batterijen in serie aan op het apparaat. (zie foto’s)
Nu de batterijen aangesloten zijn kunnen er bellen ontstaan aan de elektrode. De stalen zullen nu uit elkaar beginnen te vloeien.
Als het snelste staal het uiteinde van de gel bereikt, koppel je de batterijen los. Dit duurt ongeveer 35-40minuten.

b. Waarneming

Tijdens het koken wordt de agarose vloeibaar.Wanneer we de vormingskam verwijderen zien we putjes in de gel.

We krijgen de kleuren van onze kleurstoffen in de putjes.

Wanneer we de batterijen aansluiten zien we dat de kleuren gaan uitlopen.

Er ontstaat een “streepjescode” in gel. Deze is voor elke staal anders. De referentiestaal en staal … komen overeen.

4.Reflecteren

a. Besluit

Elektroforese lijkt een beetje op chromatografie, maar heeft een ander doel. Chromatografie wordt meestal gebruikt om verschillende componenten in een mengsel te scheiden, terwijl gelelektroforese gebruikt wordt voor DNA-fragmenten met verschillende massa en afmeting te scheiden.

Gelelektroforese is zonder twijfel een belangrijke methode bij een forensisch onderzoek. Bij deze techniek worden componenten van elkaar gescheiden door middel van een elektrisch veld. DNA-fragmenten zijn negatief geladen, waardoor ze aangetrokken worden door de positieve pool. De scheiding gebeurt meestal op basis van grootte en/of lading, maar soms ook op complexere criteria zoals structuur. Elektroforese vindt meestal plaats in een gel-medium en wordt dan gelelektroforese genoemd.

Principe:

Elektroforese betekent letterlijk het voortbewegen van deeltjes door een elektrische kracht. In een elektrisch veld zullen negatief geladen deeltjes zich bewegen naar de positieve pool (Anode) en positief geladen deeltjes zullen zich bewegen naar de negatieve pool (Kathode). De snelheid van de beweging neemt toe met de lading van de deeltjes en de sterkte van het veld. Dit zorgt dat er verschillende snelheden gaan ontstaan, waardoor hun onderlinge afstand geleidelijk toeneemt. Afhankelijk van het medium waarin de deeltjes zich bewegen kan de grootte en de structuur van de deeltjes ook een effect hebben op de bewegingssnelheid.

Medium:

Doorheen de jaren hebben de wetenschappers verschillende media uitgeprobeerd. Vanaf 1930 is men eigenlijk begonnen met elektroforese, het medium toen was sucrose. In de jaren ’50 is men dan overgegaan naar een gel op basis van zetmeel. In 1959 werden polyacrylamide-gels geïntroduceerd. En vanaf de jaren ’70 is men dan overgegaan naar een gel op basis van agar. Deze gel wordt vandaag de dag nog het meeste gebruikt voor DNA onderzoek. Als men eiwitten wil onderzoeken, gebruikt men meestal polyacrylamide-gel. DNA werd voor het eerst geïdentificeerd en geïsoleerd in 1869 door de Zwitser Friederich Miescher. Hij gaf de naam nuclein aan hetgeen dat hij ontdekt heeft. Hij wist de stoffen te zuiveren uit leukocyten (witte bloedcellen). De chemische structuur van DNA bleef nog lange tijd onbekend. Na vele jaren van onderzoek werd in 1953 de dubbele helixstructuur van DNA ontdekt door James D. Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins en Rosalind Franklin zij kregen in 1962 de Nobelprijs voor hun ontdekking. Franklin was echter al overleden aan kanker.

Ondanks de ontdekking van DNA in 1962 duurde het tot 2001 totdat het de gehele DNA sequentie van het humane genoom werd ontrafeld.Vandaag de dag wordt er nog veel onderzoek gedaan naar DNA, het is een belangrijke tak van de Biologie geworden en het vormt een kern binnen de criminologie.

b. Bronnen

KLIK – KLIK – KLIK – KLIK

5.Tips en Trics

Je kan de temperatuur van het water boven de 100°C laten komen door er een beetje zout aan toe te voegen.

Je kan aan dit experiment de lessen over DNA koppelen. Je kan bijvoorbeeld de leerlingen de proef laten uitvoeren en hen dan de opdracht geven om de simulatie over DNA te bekijken. Hierbij kan je dan een aantal vragen opstellen over DNA die de leerlingen dan moeten beantwoorden met behulp van de simulatie.

Zelf een elektroforesetoestel maken.

Benodigdheden:

Container= plastic bakje
Bakje= klein plastic bakje of botervlootje.
Stift
Schaar
Lat
Stevig karton
Aluminiumfolie
Tape
Buffermengsel
Agarosegel
Ijzerdraad
Krokodillenklem
Vijf 9V batterijen
2 kabeltjes
Kleurstoffen
Micropipet

Stappenplan:

Snijd het bakje voor het gelgebied tot ongeveer 1cm hoogte. Je kan hiervoor best eerst een lijn trekken met pen waar je moet knippen.
Snijd de twee zijkanten( kortste kanten) open. Bewaar de afgesneden stukjes voor later.

Maak een mooie rechthoekige bak. Tape de zijkanten hiervoor terug vast. Zorg ervoor dat er geen lekken ontstaan.
Nu moet je de kam maken. (Voel je vrij om andere methodes uit te proberen).
Snij een strook van ongeveer 3cm breed en 2cm langer dan de breedte van je gelgebied uit stijve karton.
Teken een lijn in het midden van je strook. Duid hierop een aantal gebieden aan:
1. 1,5cm van ieder uiteinde
2. 1 à 1,5cm tussen de verschillende streepjes. Dit moet je een beetje uitmeten afhankelijk van hoelang je gelgebied is.Maak cilindertjes van ongeveer 2,5cm lang en 3mm diameter uit aluminiumfolie. Het aantal cilindertjes dat je nodig hebt is afhankelijk van het aantal streepjes dat je bij de vorige stap getrokken hebt. Ieder streepje moet een cilinder krijgen.

Tape de cilindertjes goed vast aan het kartonnen strookje.
Hang de kam in het midden van je bakje.
Giet de gel in het bakje en laat het stollen. Als de gel gestold is kan je de tape en de kam terug verwijderen alvorens het gelgebied in de container te plaatsen. (Voorzichtig dat je de kam recht naar boven verwijderd anders wordt de gel verstoord.)
Doe in de gaatjes ongeveer 10µml kleurstof.
Plaats het bakje (zonder de tape en de kam) in de container.
Giet het buffermengsel in de container.
Neem twee ijzerdraadjes en bevestig deze in de container. Hang aan het andere uiteinde een krokodillenklem met kabel.
Bevestig de kabel aan de batterijen.
Je elektroforesetoestel is nu klaar.

6.Vaststellingen

Op het lijk: DNA van het slachtoffer. Eventueel DNA dader door bloed van een gevecht.
In de omgeving van het lijk: DNA van de dader bijvoorbeeld bloedsporen
Verzamelde bewijsstukken: DNA slachtoffer en eventueel dader

7.Verdachten

Er zijn reeds vier hoofdverdachten gevonden. Kan jij de echte dader eruit halen? Hun DNA-patroon kan je terugvinden op volgende site met een ebook: http://www.flipsnack.com/JokeJorissen/boek-elektoforese-uit-dna.html

De dader is: Astrid